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本试剂盒采用一步法荧光qRT-PCR，反应在同一管内连续进行，操作简单，并有效防止了污染，能对样品中的甲型肝炎病毒进行快速检测，具有特异性高、敏感性强和操作简便的特点。

本试剂盒适用于检测的疑似感染病人的血液等标本中甲型肝炎病毒RNA，适用于甲型肝炎病毒感染的辅助诊断，本试剂盒仅供科研使用。

• 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
  
• 所有使用的离心管最好高压灭菌，而且必须不含RNA酶。
  
• PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
  
• 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
  
• 试剂盒所有物品应视为污染物对待，并按卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

• 样品的采集
  
  • 适用标本类型：发病动物的血液、体液、脑脊液、组织以及病毒培养物等标本。
    
  • 组织：取发病组织约1g，置入1.5mL洁净EP管，立即送检。
    
  • 血液、体液、脑脊液及病毒培养物：血液，无菌注射器抽取外周血1～2mL注入EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管；体液、脑脊液及病毒培养物液等，无菌条件下取0.5～1mL左右，置入1.5mL洁净EP管，立即送检。
• RNA提取
  可采购我公司的RNA提取试剂盒(配套)或其他合适的产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
  
  • 阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。

• 试剂的准备
  从试剂盒中取出荧光qRT-PCR反应液(HAV-qRT-PCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
  设所需PCR反应管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：
  

  试剂	每个反应加入的量	N个反应加入的量
  荧光PCR反应液	14μL	N×14μL
  酶混合物	1μL	N×1μL
  总量(TotalVolume)	15μL	N×15μL

  
  计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品/阴性对照(NTC)/和阳性对照(HAV-PTC)5μL，(建议由低浓度向高浓度顺序加入反应液，避免高浓度阳性对照品污染反应液)，10000rpm瞬时离心10秒。
  
• qRT-PCR反应条件
  将各反应管放入实时荧光PCR仪器的反应槽内。推荐循环条件：
  

  步骤	循环数	反应温度时间
  反转录(Reverse Transcription)	1循环	45℃ for 10min
  预变性	1循环	95℃ for 10min
  PCR扩增(PCR amplification)	40循环	95℃ for 15sec 60℃ for 45sec

  在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM，淬灭基团：NONE，请勿选择ROX参比荧光。

• 结果分析条件设定
  直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
  
• 试验成立判定
  
  • 阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
    
  • 阳性对照(HAV-PTC)：均产生扩增曲线。
    
  • 以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
• 结果判定
  
  • 在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明HAV核酸阳性。
    
  • Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明HAV核酸阴性。
    
  • 如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
    
  • 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行HAV qRT-PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明HAV核酸阳性；否则判为样本阴性。
    
  • 标准曲线相关系数数值介于0.97～1之间。(相关系数数值等同于r2值)，根据斜率及Y轴截距列出计算公式，并通过标准曲线计算样品RNA含量拷贝数。
    例如：Y轴截距=41.5斜率=-3.83公式为：Y=-3.83(logX)+41.5